6ª postagem: Técnicas de extração e purificação de DNA
Nas últimas postagens falamos um pouco sobre casos famosos que tiveram relação com as práticas forenses, tanto no Brasil como no restante do mundo. Falamos também sobre o trabalho de um médico legista, os campos de atuação e o que se deve fazer para se tornar um.
Hoje falaremos sobre mais uma técnica para extração de DNA, e que ajuda bastante no trabalho da medicina forense.
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As técnicas de otimização da extração de DNA para a utilização na reação da polimerização em cadeia (PCR) têm permitido a investigação de diferentes amostras biológicas mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Vários campos da ciência são beneficiados com esse aperfeiçoamento, como a medicina forense, as investigações criminais, exclusão de paternidade, a busca de marcadores tumorais ou agentes infecciosos, e o transplante de medula identificando a pega do enxerto. Pontas de cigarro, saliva, esfregaço bucal, soro, bulbos capilares, entre outros, podem fornecer informações importantes desde que analisados de forma adequada.
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Um dos métodos de extração de DNA mais utilizados pela medicina forense é a extração de DNA de leucócitos periféricos. Também é útil para extração de DNA de recém-nascidos, crianças e de pacientes que vivem em locais onde a coleta e o envio da amostra de sangue não é factível. A coleta das células ocorre a partir de um swab oral. Esse método é um dos vários não invasivos que existem para obtenção de material genético.
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| Swab Oral: Material utilizado para extração de DNA de leucócitos periféricos na técnica abordada |
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| Swab sendo utilizado em uma tonsila palatina (aglomerado de tecido linfoide na cavidade oral) |
Após o colhimento das células, passa-se para o processo de extração e purificação de DNA. As células vegetais são mais difíceis de serem lisadas por causa da existência de uma parede celular envolvendo a célula. Na célula animal, é mais fácil utilizando apenas detergente.
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| A diferença na estrutura do envoltório celular em células animais e vegetais é fator de diferenciação de métodos de lise celular. O detergente é utilizado nas células animais porque as interações moleculares entre essa molécula e as moléculas dos fosfolipídeos de membrana da bicamada lipídica permite a "destruição" da membrana plasmática e a posterior obtenção do material genético. |
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| A estrutura molecular do detergente, com porção hidrofílica e porção hidrofóbica permite eficiência na lise de célula animal |
Após a obtenção do lisado contendo proteína, ácidos nucleicos (DNA/RNA) e lipídios, existe a necessidade de separar os ácidos nucleicos das outras moléculas. Está descrito na literatura variado número de diferentes métodos de recuperação e purificação de ácidos nucleicos. A técnica com fenol-clorofórmio é a metodologia mais comumente utilizada. Essa metodologia apresenta-se, com frequência, como método de purificação de alta eficiência para extração de DNA proveniente de materiais emblocados em parafina. O princípio dessa separação é a diferença de solubilidade de ácidos nucleicos, proteínas e lipídios nesses solventes orgânicos, de forma que, após a realização dessa separação, se obtém uma fase aquosa, em que se encontra o ácido nucleico. O fenol-clorofórmio utilizado após o rompimento da membrana celular auxilia na desnaturação das proteínas, que são removidas pelas subsequentes centrifugações e lavagens.
Extrair e purificar material genômico humano é um processo meticuloso e trabalhoso, com os resultados nem sempre satisfatórios, principalmente, quando se trabalha com amostras antigas, com mais de cinco anos. Após isso, os fragmentos de DNA obtidos são amplificados através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para posterior análise.
Mais informações sobre Reação em Cadeia da Polimerase em:
http://bioquimicaforense.blogspot.com.br/2014/10/eduardo-campos-morte-que-pegou-de.html
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302005000600019&lang=pt
http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0037-86822009000600008&script=sci_arttext
http://seer.ucg.br/index.php/estudos/article/viewFile/565/450
http://revistas.pucgoias.edu.br/index.php/estudos/article/viewFile/565/450
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842004000400001&lang=pt
