6ª postagem: Técnicas de extração e purificação de DNA
Nas últimas postagens falamos um pouco sobre casos famosos que tiveram relação com as práticas forenses, tanto no Brasil como no restante do mundo. Falamos também sobre o trabalho de um médico legista, os campos de atuação e o que se deve fazer para se tornar um.
Hoje falaremos sobre mais uma técnica para extração de DNA, e que ajuda bastante no trabalho da medicina forense.
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As técnicas de otimização da extração de DNA para a utilização na reação da polimerização em cadeia (PCR) têm permitido a investigação de diferentes amostras biológicas mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Vários campos da ciência são beneficiados com esse aperfeiçoamento, como a medicina forense, as investigações criminais, exclusão de paternidade, a busca de marcadores tumorais ou agentes infecciosos, e o transplante de medula identificando a pega do enxerto. Pontas de cigarro, saliva, esfregaço bucal, soro, bulbos capilares, entre outros, podem fornecer informações importantes desde que analisados de forma adequada.
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Um dos métodos de extração de DNA mais utilizados pela medicina forense é a extração de DNA de leucócitos periféricos. Também é útil para extração de DNA de recém-nascidos, crianças e de pacientes que vivem em locais onde a coleta e o envio da amostra de sangue não é factível. A coleta das células ocorre a partir de um swab oral. Esse método é um dos vários não invasivos que existem para obtenção de material genético.
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| Swab Oral: Material utilizado para extração de DNA de leucócitos periféricos na técnica abordada |
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| Swab sendo utilizado em uma tonsila palatina (aglomerado de tecido linfoide na cavidade oral) |
Após o colhimento das células, passa-se para o processo de extração e purificação de DNA. As células vegetais são mais difíceis de serem lisadas por causa da existência de uma parede celular envolvendo a célula. Na célula animal, é mais fácil utilizando apenas detergente.
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| A diferença na estrutura do envoltório celular em células animais e vegetais é fator de diferenciação de métodos de lise celular. O detergente é utilizado nas células animais porque as interações moleculares entre essa molécula e as moléculas dos fosfolipídeos de membrana da bicamada lipídica permite a "destruição" da membrana plasmática e a posterior obtenção do material genético. |
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| A estrutura molecular do detergente, com porção hidrofílica e porção hidrofóbica permite eficiência na lise de célula animal |
Após a obtenção do lisado contendo proteína, ácidos nucleicos (DNA/RNA) e lipídios, existe a necessidade de separar os ácidos nucleicos das outras moléculas. Está descrito na literatura variado número de diferentes métodos de recuperação e purificação de ácidos nucleicos. A técnica com fenol-clorofórmio é a metodologia mais comumente utilizada. Essa metodologia apresenta-se, com frequência, como método de purificação de alta eficiência para extração de DNA proveniente de materiais emblocados em parafina. O princípio dessa separação é a diferença de solubilidade de ácidos nucleicos, proteínas e lipídios nesses solventes orgânicos, de forma que, após a realização dessa separação, se obtém uma fase aquosa, em que se encontra o ácido nucleico. O fenol-clorofórmio utilizado após o rompimento da membrana celular auxilia na desnaturação das proteínas, que são removidas pelas subsequentes centrifugações e lavagens.
Extrair e purificar material genômico humano é um processo meticuloso e trabalhoso, com os resultados nem sempre satisfatórios, principalmente, quando se trabalha com amostras antigas, com mais de cinco anos. Após isso, os fragmentos de DNA obtidos são amplificados através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para posterior análise.
Mais informações sobre Reação em Cadeia da Polimerase em:
http://bioquimicaforense.blogspot.com.br/2014/10/eduardo-campos-morte-que-pegou-de.html
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-27302005000600019&lang=pt
http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0037-86822009000600008&script=sci_arttext
http://seer.ucg.br/index.php/estudos/article/viewFile/565/450
http://revistas.pucgoias.edu.br/index.php/estudos/article/viewFile/565/450
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842004000400001&lang=pt
Existem cuidados que devem ser tomados na extração e amplificação de amostras de DNA do sangue, pois a hemoglobina, que contem ions de ferro, pode inibir a ação da DNA polimerase. Por isso é importante separar as células nucleadas das anucleadas antes de se extrair DNA sanguíneo para amplificação. Deve-se também, evitar ao máximo, hemólise da amostra de sague
ResponderExcluirFONTE:
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-84842004000400008&script=sci_arttext
Além da técnica de fenol-clorofórmio, uma técnica que está sendo amplamente empregada nos kits atuais é baseada em sílica. Funciona da seguinte maneira: o DNA adsorve especificamente a membranas/superfícies/partículas de sílica em presença de certos sais e em um determinado pH. Os contaminantes celulares são removidos por etapas de lavagens e o DNA pode finalmente ser eluído em um tampão com baixa concentração de sal ou em um tampão de eluição. Sais caotrópicos são adicionados para ajudar na desnaturação das proteínas e extração do DNA. Esse método possui vantagens em relação ao método orgânico (de fenol-clorofórmio), que são: ela pode ser incorporada em spin columns e micro chips, é rentável, tem um procedimento simples rápido (comparado com a extração orgânica) e pode ser automatizada.
ResponderExcluirFonte: http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
Dentre as vantagens da utilização da técnica do swab oral em relação à coleta de sangue destacam-se: A coleta é feita escovando a parte interna da bochecha com uma escovinha (swab oral), de forma rápida, indolor e não invasiva. É indicada para quem tem aversão a coleta de sangue, para crianças e recém-nascidos. O DNA obtido na extração é de alta qualidade e pureza para a realização do exame. O transporte das amostras pode ser feito à temperatura ambiente com total segurança. Não há problemas de interferências em relação à transfusão sanguínea ou transplante de medula de pessoas envolvidas no exame, garantindo qualidade e confiabilidade total. Fonte: http://dnaconsult.com.br/h_coleta.php
ResponderExcluirO DNA de boa qualidade é fundamental para identificar os portadores de mutações para tratamento e aconselhamento genético. A identificação dessas mutações em DNA obtido de sangue periférico é um procedimento habitual, entretanto há dificuldades na coleta de sangue em crianças e no encaminhamento das amostras de pacientes e familiares que vivem em locais distantes e de difícil acesso. A coleta de material utilizando células de mucosa oral, rotineiramente empregada em medicina forense, pode ser então uma boa alternativa para obtenção de DNA.
ResponderExcluirReferência:
http://www.scielo.br/pdf/abem/v49n6/27401.pdf
A maioria das amostras de DNA devem ser amplificadas para se ter uma melhor análise. A amplificação vem depois da extração e da purificação, sendo o melhor metodo, a PCR, citada na postagem. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura
ResponderExcluirMuitos testes genéticos envolvidos em estudos de doenças humanas necessitam da utilização do DNA genômico extraído de amostras de sangue. Normalmente, o DNA genômico é obtido a partir da separação da camada de células brancas (buffy-coat) ou do sangue total. Frequentemente, ensaios genéticos envolvendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a extração de DNA, utilizam amostras de sangue coletadas com anticoagulantes3. Com isso, é possível a separação de células e plasma do sangue por centrifugação e, portanto, a retirada da camada de células nucleadas. No entanto, em muitos laboratórios, amostras de sangue coletadas para sorologia não utilizam anticoagulante e são descartadas, por serem inviáveis para os estudos genéticos, uma vez que a extração de DNA genômico destas amostras é dispendiosa e os resultados não são satisfatórios.
ResponderExcluirhttp://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0037-86822009000600008&script=sci_arttext
Os passos básicos envolvendo a extração de DNA a partir de células e tecidos animais é o mesmo discutido na introdução e para microrganismos. Só que os kits precisaram fazer algumas modificações para incorporar algumas características especificas das células animais. A cultura e o preparo das células é bastante diferentes em relação à s células microbianas. Como dito na postagem, as células animais não tem parede celular como as células microbianas, consequentemente é mais fácil lisar usando apenas detergente.Lembrando que a lise é necessária para libertar o material genético que normalmente está limitado pela carioteca(membrana nuclear). Mas primeiro o tecido precisa ser mecanicamente homogeneizado ou tratado com enzimas. A lise celular é seguida da separação do DNA de outros componentes celulares, e então sua purificação. Vários kits não utilizam a extração orgânica convencional, e sim a extração com fenol/clorofórmio seguido de precipitação com etanol. Isto é útil pois minimiza o dano que os solventes orgânicos poderiam causar ao DNA
ResponderExcluirFonte: http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
Nessa questão abordada, devemos ressaltar a importância da obtenção de DNA por métodos não invasivos, mesmo que em pequenas quantidades, principalmente em recém-nascidos. Além disso, a obtenção do DNA genômico pelos métodos convencionais necessita de vários passos laboratoriais que tornam o procedimento longo e fazem com que o rendimento e a pureza do material nem sempre sejam adequados e que as concentrações inicialmente estimadas necessitem de reajustes para a seqüência do protocolo. Além disso, a excessiva manipulação da amostra pode degradar o DNA em vários níveis. Mesmo assim, é importante citar que utilização das células obtidas através de esfregaço bucal para a obtenção de DNA tem sido criticada por alguns autores pela variação no rendimento e qualidade do DNA.
ResponderExcluirFonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-84842004000400001&script=sci_arttext
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