7a POSTAGEM: EXTRAÇÃO DE DNA
Continuando o conteúdo das postagens anteriores, hoje daremos prosseguimento ao tema "extração de DNA" com novas informações. De início, é válido afirmar que não são poucos os casos em que a disponibilidade de material genético para análises forenses é bastante escassa, podendo ser fios de cabelo, gotas de esperma, resquícios de saliva, restos celulares em dentes arrancados ou sob unhas, sangue, ossos e tecidos de cadáveres decompostos; escarro, suco pancreático, bile e outros fluidos corpóreos que possam ser congelados e guardados, ou encontrados em diferentes situações.
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| Desvendar o que está escondido no DNA é informação imprescindível para a medicina forense. |
Tendo em vista essa situação, é de grande importância pesquisar métodos alternativos de extração de DNA que possam ser rápidos, práticos, baratos, livres de contaminação e de toxicidade e eficazes no que tange à quantidade, qualidade e possibilidade de amplificação por PCR, do DNA extraído. Isso pode possibilitar a aplicação da pesquisa em outros estudos, como diagnósticos retrospectivos, identificação de indivíduos, estudos populacionais, envios de amostras à distância e aplicações na Medicina Forense.
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| PCR - Reação em Cadeia da Polimerase - é um método importante e frequentemente usado após a extração do DNA |
Na última postagem abordamos um pouco sobre uma técnica de extração de moléculas de DNA a partir da mucosa bucal. Entretanto, a utilização das células obtidas através de esfregaço bucal para a obtenção de
DNA tem sido criticada por alguns autores pela variação no rendimento e
qualidade do DNA obtido.
Pesquisadores relatam a importância da obtenção de DNA por métodos não
invasivos, mesmo que em pequenas quantidades, principalmente em recém-nascidos.
O grupo utilizou um protocolo específico para a obtenção de DNA diretamente da
amostra biológica sem a necessidade de manipulação amplificando o genoma global e gerando uma grande quantidade de DNA a partir de poucas células em comparação
ao método convencional de extração e purificação.
Um ponto importante faz referência à extração de DNA por amostras de sangue. No entanto, em muitos laboratórios, amostras de sangue
coletadas para sorologia não utilizam anticoagulante e são descartadas, por
serem inviáveis para os estudos genéticos, uma vez que a extração de DNA
genômico destas amostras é dispendiosa e os resultados não são satisfatórios.
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| Extração de DNA de uma amostra de sangue é um método sujeito à vários fatores externos |
Com isso, uma técnica rápida e eficiente de extração de DNA
de sangue coagulado se faz necessária, uma vez que materiais biológicos que
podem ser utilizados para muitos estudos genéticos são descartados
rotineiramente. Além disso, esta metodologia pode representar mais uma opção
para a extração de DNA de amostras cujo anticoagulante foi ineficaz.
A qualidade
de um produto está diretamente relacionada com a qualidade dos processos a que
é submetido. A
compreensão dos fatores que estão envolvidos direta ou indiretamente no processo
de extração de macromoléculas é fundamental para o resultado final do processo.
A concepção de fatores, como tipo de fixador, utilização (ou não) de
descalcificadores e tipo de tecido, é um dos aspectos que vai influenciar a
extração. Essa compreensão é importante na definição de qual método de extração
será utilizado.
Assim, um estudo prévio de todo o sistema, desde o tipo de
tecido até a escolha do método de extração e purificação, trará informações de
possíveis fatores adversos que podem vir a influenciar na qualidade das
macromoléculas. Caberá ao pesquisador interpretar e tentar solucionar ou minimizar
o problema.
Fontes:
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-84842004000400001&script=sci_arttext
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0037-86822009000600008&script=sci_arttext
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352004000100017&script=sci_arttext
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1516-84842004000400008&script=sci_arttext
http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v47n5/v47n5a08.pdf
Uma das formas de extração e posterior estocagem de amostras de fragmentos de DNA é a formação de uma biblioteca genômica, que pode, inclusive, ser de grande serventia na solução de crimes na medicina forense. É feita a partir de uma amostra de DNA, que é então aleatoriamente cortada em fragmentos menores por uma enzima de restrição não específica e então posta em vetores como os fagos-gama para que se multiplique os fragmentos e tenham maiores chances de isolar genes importantes. Após essa amplificação do DNA, ele é tranferidos para hospedeiros, geralmente bactérias de Escherichia Colli, para serem guardados e estocados. Esses genes podem ser, posteriormente utilizados para fundamentarem diversos assuntos, sendo alguns deles usados na bioquímica forense. Esse método não apresenta os defeitos da extração de amostras bucais como citado na postagem, e as amostras da biblioteca genômica são de extrema qualidade estrutural e funcional.
ResponderExcluirFonte: aulas do Professor Fernando Aécio.
Frequentemente, ensaios genéticos envolvendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a extração de DNA, utilizam amostras de sangue coletadas com anticoagulantes. Com isso, é possível a separação de células e plasma do sangue por centrifugação e, portanto, a retirada da camada de células nucleadas. No entanto, em muitos laboratórios, amostras de sangue coletadas para sorologia não utilizam anticoagulante e são descartadas, por serem inviáveis para os estudos genéticos, uma vez que a extração de DNA genômico destas amostras é dispendiosa e os resultados não são satisfatórios. Muitos métodos para o isolamento de DNA de amostras coaguladas foram descritos e alguns deles enfocam a obtenção de um DNA satisfatório para a PCR. Outras técnicas se preocupam com amostras de DNA de alta qualidade, porém são procedimentos demorados e bastante trabalhosos, envolvendo processos de homogeneização do coágulo. Portanto, deve-se atentar para qual das técnicas de extração de DNA escolher, com base da situação e da abundância de material.
ResponderExcluirFonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0037-86822009000600008&script=sci_arttext
As técnicas de extração de DNA e uso da PCR possuem uma grande variedade de aplicações, por exemplo, na identificação de salmonelas em ovos. A busca da metodologia ideal para o diagnóstico das salmoneloses nos animais, nos alimentos e no homem começou no momento da sua descrição como agente patogênico e permanece até hoje. Várias alternativas têm sido pesquisadas como imunoensaios, imunodifusão, aglutinação em látex, e hibridização do DNA. A ocorrência de surtos de intoxicação alimentar por salmonelas em diversos países chamou a atenção para fontes comuns de infecção. As investigações epidemiológicas identificaram o consumo de ovos ou alimentos contendo ovos como responsáveis pela maioria dos surtos. Os métodos analíticos para pesquisa de Salmonella em ovos e outros produtos,definem como sendo o diagnóstico bacteriológico com isolamento e identificação do agente a técnica oficial recomendada (BRASIL, 1995), porém muitas pesquisas têm sido realizadas visando a introduzir metodologias rápidas e sensíveis para enfrentarem a agilidade que o mercado atual exige. O desenvolvimento de testes de imunocaptura (IMS) e amplificação do DNA pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ou biosensores trouxe mais rapidez e precisão, com resultados sendo obtidos em torno de 24 horas. Além disso, OYARZÁBAL observou que a PCR foi a técnica de maior aceitação entre as demais técnicas moleculares desenvolvidas recentemente, podendo ser empregada como ferramenta de diagnóstico em laboratórios clínicos. Nessa pesquisa, pode-se concluir que a metodologia de extração de DNA pelo fenol-clorofórmio, da forma aqui empregada foi mais efetiva na recuperação de salmonelas em ovos, tanto com casca (72%), como sem casca (86%). A favor da metodologia térmica, tem-se o tempo de diagnóstico, reduzido em seis horas, pouca manipulação das amostras e custo menor.
ResponderExcluirFonte: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-84782001000200020
Uma das coisas que mais torna a reação de cadeia de polimerase um procedimento atrativo é o seu baixo custo, a rapidez com que é feita e o fato de que se podem achar os meteriais com relativa facilidade. Os primers necessários para a reação , por exemplo, são obtidos sob encomenda, desde que se saiba a sequência de nucleotídeos a ser usada como iniciadora. Essa sequência é de fundamental importância por que a DNA polimerase não consegue agir se não houver uma extremidade 3' disponível para adição de novos nucleotídeos, e essa condiçãoo é atendida pela presença dos primers, que pareiam com as regiões de iniciação.
ResponderExcluirFONTE:http://customarrayinc.com/oligos_adGoogle201403.htm?gclid=Cj0KEQiAs6GjBRCy2My09an6uNIBEiQANfY4zLiFJevKj6m66Q7gsuB3iPG7ARNEuGQPG-B_gkk5QikaAkxJ8P8HAQ
Ao citarmos a técnica do PCR, é necessário uma revisão sobre a mesma. A técnica de PCR surgiu com o descobrimento da bactéria Thermus Aquaticus e de sua enzima DNA-polimerase que permite não ser necessário o uso de um ser vivo durante a técnica. Dessa forma, conseguimos um método mais eficaz, eficiente, automático e que não necessitava de grandes gastos de dinheiro e tempo como a técnica anterior( antes, era necessário adicionar uma nova enzima a cada ciclo, pois ela era destruida pela desnaturação). A técnica baseia-se, de modo mais amplo, em desnaturação do DNA, hibridização dos primers e, por fim, extensão do primers, ocorrendo isso a cada ciclo
ResponderExcluirFonte: Aulas do professor Max
Os métodos analíticos para pesquisa de Salmonella em ovos e outros produtos,definem como sendo o diagnóstico bacteriológico com isolamento e identificação do agente a técnica oficial recomendada , porém muitas pesquisas têm sido realizadas visando a introduzir metodologias rápidas e sensíveis para enfrentarem a agilidade que o mercado atual exige.
ResponderExcluirO desenvolvimento de testes de imunocaptura (IMS) e amplificação do DNA pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ou biosensores trouxe mais rapidez e precisão, com resultados sendo obtidos em torno de 24 horas.Além disso, OYARZÁBAL observou que a PCR foi a técnica de maior aceitação entre as demais técnicas moleculares desenvolvidas recentemente, podendo ser empregada como ferramenta de diagnóstico em laboratórios clínicos.
Como dito na postagem, a qualidade de um produto está diretamente relacionada com a qualidade dos processos a que é submetido. Essa qualidade, por sua vez depende, nos exames laboratoriais na constante autoavaliação para diminuir a chance de erros, aumentando a exatidão e sempre mantendo a precisão. Uma das maneiras de realizar essa autoavaliação é através da calibração dos aparelhos.
ResponderExcluirEsta deve ser realizada através de um material de referência, que são os Padrões e os Soros Calibradores
-PADRÕES:
É o analito purificado dissolvido em água ou solução alcoólica adicionado de conservantes. As propriedades fisico quimicas (viscosidade e densidade) no qual foram preparados são bastante diferentes das propriedades da amostra humana. São recomendados para procedimentos de calibração de equipamentos manuais ou semi automáticos. Nestes testes os volumes de amostra utilizados geralmente são maiores, portanto, estão menos propensos a desvios de calibração.
-SORO CALIBRADOR
É o soro valorado por inúmeras análises com materiais de referência. Por serem oriundos de materiais biológicos estabilizados com conservantes, as propriedades fisico químicas do material são semelhantes à do soro ou plasma. Recomendados para calibração de equipamentos automatizados.
Fonte: http://www.blogbiotecnica.ind.br/blog/2011/12/calibracao/
Existem várias técnicas para extração do DNA, que utilizam diferentes metodologias e espécimes biológicos. O sangue é muito utilizado para extração de DNA porque é fonte abundante de informação genética e por fornecer amostra fresca para análise (a maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos). No entanto, muitos outros materiais podem ser efetivamente analisados: células epiteliais da mucosa oral; unhas, pêlos e fios de cabelo (região do bulbo capilar); manchas de material biológico (líquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, têxtil; ossos carbonizados, ossadas ou dentes; material anatomopatológico; e inclusive células deixadas por impressão digital em selos, filtros de cigarro, copos, talheres e telefone.
ResponderExcluirReferências:
http://www.ebah.com.br/content/ABAAABanwAK/relatorio-extracao-purificacao-dna-eletroforese