10a postagem: BIBLIOTECA GENÔMICA E DE cDNA; ANÁLISE FINAL
Algo de grande importância na medicina forense é saber a constituição genética de um indivíduo. Ao prosseguir das postagens, abordamos vários métodos de obtenção do material genético, bem como sua extração. Estudamos também técnicas de análise desse material, através de métodos como a eletroforese e a impressão digital de DNA. Além disso, quando o material é escasso, pode-se utilizar o método da reação em cadeia da polimerase para amplificação desse material sem a necessidade de organismos vivos (ou seja, uma técnica in vitro), para que as possibilidades de trabalho se elevem. Concomitante a isso, abordamos vários eventos que ocorreram no Brasil e no restante do mundo que envolvia, direta ou indiretamente, a medicina forense, como o caso de Jack, o Estripador, Isabella Nardoni, Eduardo Campos, etc... Aproveitamos o espaço também para falar de temas que estão menos em destaque, como as condições, fatores e características associadas à profissão de um médico legista, e da Psiquiatria Forense, uma área da medicina forense bastante importante, mas que muitas vezes não tem seu valor e sua importância reconhecidos. Com a 10a postagem, que abordará o tema de bibliotecas genômicas e de cDNA, encerramos esse ciclo de importantes informações, que são vitais para o entendimento dessa grande especialidade médica, que tem provado seu lugar dentro da sociedade moderna. Boa Leitura!
_________________________________________________________________________________
BIBLIOTECA GENÔMICA
As biblioteca são coleções de sequências de DNA usadas para armazenar informações. As bibliotecas genômicas representam a totalidade do genoma de um determinado organismo. Além de um uso em medicina forense, as bibliotecas também podem ser utilizadas para:
• isolamento de um gene específico;
• sequenciamento;
• clonagem;
• identificação de genes em diferentes especies;
• análise de proteínas relacionadas;
Uma biblioteca genômica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantes de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada porção de DNA. A separação da porção do DNA genômico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obter informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas.
O ponto ao qual se dá mais relevo na construção de uma biblioteca genômica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é necessário estimar o tamanho necessário da biblioteca através do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do genoma.
A construção de uma biblioteca genômica envolve basicamente os seguintes passos:
--> Isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente é quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vector.
--> Ligação desses fragmentos ao vector e introdução dos recombinantes obtidos nas células hospedeiras.
 |
| Método simplificado de obtenção de uma biblioteca genômica |
BIBLIOTECA DE cDNA
Ao contrário de uma biblioteca genômica, que contém em princípio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contém apenas os genes expressos pelas células empregadas na extração de mRNA, e ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das células no laboratório. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com células da mucosa gástrica terá muitos genes diferentes de uma outra biblioteca feita a partir da mucosa oral. Mas também terá muitos outros iguais, pois há genes que são expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.
Ao contrário de uma biblioteca genômica, que contém em princípio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contém apenas os genes expressos pelas células empregadas na extração de mRNA, e ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das células no laboratório. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com células da mucosa gástrica terá muitos genes diferentes de uma outra biblioteca feita a partir da mucosa oral. Mas também terá muitos outros iguais, pois há genes que são expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.
O cDNA é uma cópia da mensagem, não possuindo assim intrões e apresentando poucas sequências que não codificam proteínas. Esta ausência de intrões permite a direta transcrição e tradução dos cDNA de células eucarióticas superiores, em bactérias e outros micro-organismos, o que permite a produção em massa de polipeptídeos importantes. A inexistência de intrões facilita igualmente a determinação direta da sequência da mensagem codificada e dedução subsequente da sequência de aminoácidos da proteína por ela codificada, o que se tem demonstrado extremamente útil na identificação de inúmeras proteínas que ainda não o tinham sido genética ou bioquimicamente.
 |
| Esquema mostrando bem simplificadamente como se processa a obtenção de uma biblioteca de cDNA |
 |
| Esquema um pouco mais completo que mostra a ação de um primer que se liga à cauda poli-A de um RNA mensageiro depois das modificações pós-transcricionais. Observe a ação da enzima transcriptase reversa na obtenção de uma molécula de DNA a partir de um mRNA |
 |
| Método de identificação de moléculas de cDNA de interesse |
Observe agora um esquema que mostra as diferenças principais entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA:
 |
| Esse esquema mostra as diferenças entre os processos e os resultados em bibliotecas genômicas e de cDNA |
MOMENTO BÔNUS
Uma das principais funções na construção de bibliotecas genômicas e de cDNA é a possibilidade de se identificar o "perfil genético" de um indivíduo, o que facilita na busca de suspeitos e no julgamento em casos de crimes. Faz-se comparações do material obtido com os materiais dos possíveis suspeitos e, dar-se posteriormente, o veredicto final.
Esse modelo de manipulação do material genético é acompanhado de várias outras formas, como o caso de uma "impressão digital de DNA" (tema da postagem anterior). Uma impressão digital de DNA ocorre através de vários processos, que envolvem a fragmentação de DNA por endonucleases de restrição, uso de gel de agarose, eletroforese e chapa de Raio X.
Para verificar como ocorrem esses processos, entre no endereço abaixo e descubra quem foi o suspeito identificado do crime fictício em questão!
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
_________________________________________________________________________________
Aqui termina mais um ciclo de postagens. Espero que os leitores tenham aprendido bastante com o tema e que saibam usar as informações obtidas aqui para os devidos fins. Esse foi o principal objetivo desse trabalho. Esse foi o "Bioquímica na luta contra o crime"! Até mais!
_________________________________________________________________________________
Fontes:
http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliocdna.htm
http://slideplayer.com.br/slide/370893/
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Clonagem%20molecular.pdf
https://www.ufpe.br/biolmol/aula5_clonagem1.htm
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
https://www.ufpe.br/biolmol/aula6_clonagem2.htm
http://www.biologia.ufrj.br/~coelho/cursos/genbasmol/genonze.htm
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
https://www.ufpe.br/biolmol/aula6_clonagem2.htm
http://www.biologia.ufrj.br/~coelho/cursos/genbasmol/genonze.htm
Fazendo a comparação entre as bibliotecas de cDNA e as bibliotecas genômicas, é possível perceber algumas vantagens da biblioteca de cDNA: Uma biblioteca de cDNA é, muitas vezes, preferencialmente utilizada para se iniciar a clonagem de um gene. Isto, deve-se ao facto de, sendo o cDNA (DNA complementar) derivado do mRNA (RNA mensageiro), para uma proteína expressa na célula, obtêm-se bibliotecas em que a sua representação é significativamente maior do que em bibliotecas genómicas, o que auxilia o seu isolamento. Outra vantagem é poder deduzir-se facilmente a sequência da proteína pois o cDNA de eucariotas é uma cópia do mRNA processado. Além disso, a biblioteca de cDNA tem a vantagem de poderem ser expressadas ao serem introduzidas em vetores de organismos procariontes, diferente das de DNA genômico, que não podem ser expressas em bactérias já que estas não possuem mecanismos para retirar os íntrons (splicing genético). Na produção das bibliotecas de cDNA é importante destacar o papel fundamental da enzima transcripitase reversa, que irá transformar a molécula de mRNA em DNA complementar, que estará isento de íntrons. Interessante que na natureza os retrovírus, como o vírus do HIV, utilizam-se de mecanismos semelhantes para a expressão de seu material genético.
ResponderExcluirFonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliocdna.htm
Aulas de Biomol do Prof. Fernando Aécio
Bibliotecas de cDNA não são construídas somente com o objetivo de isolar uma ou algumas sequências gênicas relacionados a um processo específico ou para isolar genes que são diferencialmente expressos em função de uma condição de estudo, como no caso das bibliotecas de cDNA subtrativas (sobre as quais não vou falar aqui). O isolamento e sequenciamento, em grande escala, de clones de cDNA a partir de bibliotecas de expressão tem se tornado uma boa alternativa para o sequenciamento do DNA genômico na identificação de novas sequências gênicas. São necessários menos recursos e a estrutura dos genes é prontamente identificada, ao contrário das sequências genômicas que em eucariotos são interrompidas por íntrons, sendo necessário lançar mão de ferramentas de bioinformática para tentar prever a estrutura do gene e a seqüência expressa. Além disso, em uma biblioteca de DNA genômico, a maior parte dos clones não contém sequências gênicas, sendo o isolamento destas, muito mais trabalhoso.
ResponderExcluirReferências:
http://engenhariageneticabioq.page.tl/Bibliotecas-de-DNA-Gen%F3mico-e-cDNA.htm
Para a construção de uma bibioteca genômica é necessário que haja os seguintes processos: extração, amplificação e estocagem. As bibliotecas genômicas podem ser de grande serventia na solução de crimes na medicina forense. É feita a partir de uma amostra de DNA, que é então aleatoriamente cortada em fragmentos menores por uma enzima de restrição não específica e então posta em vetores como os fagos-gama para que se multiplique os fragmentos e tenham maiores chances de isolar genes importantes. Após essa amplificação do DNA, ele é tranferidos para hospedeiros, geralmente bactérias de Escherichia Colli, para serem guardados, sendo esse o considerado processo de estocagem. Esses genes podem ser, posteriormente utilizados para fundamentarem diversos assuntos, sendo alguns deles usados na bioquímica forense. Esse método possui peculiaridades, como por exemplo, não apresenta defeitos da extração por amostras bucais e as amostras da biblioteca genômica são de extrema qualidade estrutural, funcional e rapidez, podendo, portanto identificar de modo eficiente todo o perfil genético do indivíduo, como foi dito na postagem.
ResponderExcluirFonte: aulas do Professor Fernando Aécio.
Uma biblioteca de cDNA é, muitas vezes, preferencialmente utilizada para se iniciar a clonagem de um gene. Isto, deve-se ao fato de, sendo o cDNA (DNA complementar) derivado do mRNA (RNA mensageiro), para uma proteína expressa na célula, obtêm-se bibliotecas em que a sua representação é significativamente maior do que em bibliotecas genômicas, o que auxilia o seu isolamento. Outra vantagem é poder deduzir-se facilmente a sequência da proteína pois o cDNA de eucariotas é uma cópia do mRNA processado. Dessa forma, a isolação do incerto fica bem mais simples com o uso da biblioteca que possui apenas regiões codificantes. Entretanto, como sinalizado pela postagem, o uso de biblioteca genômica é mais abrangente e, por isso, é o mais usado quando se precisa diferenciar seres distintos, já que as regiões codificantes entre os seres de uma mesma espécie são praticamente iguais.
ResponderExcluirFonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliocdna.htm
Apesar de aparentemente não tão complexo, o processo de formação de bibliotecas de cDNA está sujeito a vários empecilhos. A instabilidade do RNA, por exemplo, pode ser um problema, já que dificulta o isolamento de sequências completas. Além disso, durante a retrotranscrição e amplificação do cDNA, pode ocorrer a amplificação incompleta dos fragmentos e o PCR tem a tendência de amplificar sequências curtas mais eficientemente que as longas, sendo muitas sequências completas perdidas nesse processo. Outro problema diz respeito à “redundância” da biblioteca. Isso se deve à grande variabilidade do número de cópias de mRNA por gene.
ResponderExcluirFonte: http://rnasefree.blogspot.com.br/2008/04/bibliotecas-de-cdna.html
Ao falarmos do assunto abordado na ultima postagme, é importnte tratarmos também sobre o projeto genoma humano. O Projeto Genoma Humano (PGH) teve por objetivo o mapeamento do genoma humano, e a identificação de todos os nucleotídeos que o compõem. Consistiu num esforço mundial para se decifrar o genoma. Para o seqüenciamento de um gene, é necessário que ele seja antes amplificado numa reação em cadeia da polimerase, e então clonado em bactérias. Após a obtenção de quantidade suficiente de DNA, executa-se uma nova reação em cadeia (PCR), desta vez utilizando didesoxirribonucleotídeos marcados com fluoróforos para a determinação da seqüência.
ResponderExcluirFonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo5.php
A tipagem humana por DNA, metodologia que se constitui como a mais eficiente dentre aquelas aplicadas à identificação humana, tem como berço experimentos realizados há cerca de 25 anos, quando sequências nucleotídicas repetidas “in tandem”, denominadas de VNTR, do inglês “Variable Number of Tandem Repeats”, foram inicialmente identificadas durante o rastreamento com sondas moleculares de uma biblioteca genômica humana. Em estudos subsequentes, sequências VNTR foram verificadas franqueando genes estruturais e pseudo-genes.
ResponderExcluirSequências VNTR são encontradas distribuídas aleatoriamente no genoma, consistindo em minisatélites com enorme variabilidade de tamanho. De uma maneira geral, as regiões VNTR apresentam unidades de repetição compreendendo entre 10 e 100 pares de bases. Tendo em vista suas características, a possibilidade de se analisar regiões VNTR se relaciona com a possibilidade de se obter preparações de DNA nas quais a macromolécula se apresente íntegra, com alto peso molecular, independentemente de a amostra biológica ter sido coletada "in vivo" ou "post-mortem"
FONTE:http://www.ldd.uerj.br/eradodna.htm
Para ter a garantia que esta digestão atinge todo o genoma, são utilizadas enzimas de restrição que cortam frequentemente o DNA, não apresentando desvios de preferência de sítios. Com este fim, a enzima Sau3A I é utilizada frequentemente pois reconhece o sítio de 4 bases GATC, gerando fragmentos compatíveis com sítios de clonagem de vários fagos e cosmídeos (estatisticamente, uma sequência de 4 nucleótidos aparece, em média, cada 256 pares de bases). Há secções de DNA que possuem as sequências de conhecimento muito espaçadas, especialmente as de enzimas que cortam menos frequentemente, o que leva a uma maior probabilidade de gerar fragmentos de certas zonas de DNA, muito grandes para serem clonados e os genes aí existentes não estariam representados na biblioteca genómica. O corte parcial do DNA é feito em condições (relação enzima/DNA baixa ou tempo de digestão limitado) que maximizem a obtenção de fragmentos com um tamanho de cerca de 20 kb, um tamanho razoável para substituir o fragmento central do fago.
ResponderExcluirhttp://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliogenom_frame.htm