10a postagem: BIBLIOTECA GENÔMICA E DE cDNA; ANÁLISE FINAL
Algo de grande importância na medicina forense é saber a constituição genética de um indivíduo. Ao prosseguir das postagens, abordamos vários métodos de obtenção do material genético, bem como sua extração. Estudamos também técnicas de análise desse material, através de métodos como a eletroforese e a impressão digital de DNA. Além disso, quando o material é escasso, pode-se utilizar o método da reação em cadeia da polimerase para amplificação desse material sem a necessidade de organismos vivos (ou seja, uma técnica in vitro), para que as possibilidades de trabalho se elevem. Concomitante a isso, abordamos vários eventos que ocorreram no Brasil e no restante do mundo que envolvia, direta ou indiretamente, a medicina forense, como o caso de Jack, o Estripador, Isabella Nardoni, Eduardo Campos, etc... Aproveitamos o espaço também para falar de temas que estão menos em destaque, como as condições, fatores e características associadas à profissão de um médico legista, e da Psiquiatria Forense, uma área da medicina forense bastante importante, mas que muitas vezes não tem seu valor e sua importância reconhecidos. Com a 10a postagem, que abordará o tema de bibliotecas genômicas e de cDNA, encerramos esse ciclo de importantes informações, que são vitais para o entendimento dessa grande especialidade médica, que tem provado seu lugar dentro da sociedade moderna. Boa Leitura!
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BIBLIOTECA GENÔMICA
As biblioteca são coleções de sequências de DNA usadas para armazenar informações. As bibliotecas genômicas representam a totalidade do genoma de um determinado organismo. Além de um uso em medicina forense, as bibliotecas também podem ser utilizadas para:
• isolamento de um gene específico;
• sequenciamento;
• clonagem;
• identificação de genes em diferentes especies;
• análise de proteínas relacionadas;
Uma biblioteca genômica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantes de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada porção de DNA. A separação da porção do DNA genômico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obter informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas.
O ponto ao qual se dá mais relevo na construção de uma biblioteca genômica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é necessário estimar o tamanho necessário da biblioteca através do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do genoma.
A construção de uma biblioteca genômica envolve basicamente os seguintes passos:
--> Isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente é quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vector.
--> Ligação desses fragmentos ao vector e introdução dos recombinantes obtidos nas células hospedeiras.
Método simplificado de obtenção de uma biblioteca genômica |
BIBLIOTECA DE cDNA
Ao contrário de uma biblioteca genômica, que contém em princípio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contém apenas os genes expressos pelas células empregadas na extração de mRNA, e ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das células no laboratório. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com células da mucosa gástrica terá muitos genes diferentes de uma outra biblioteca feita a partir da mucosa oral. Mas também terá muitos outros iguais, pois há genes que são expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.
Ao contrário de uma biblioteca genômica, que contém em princípio qualquer fragmento de DNA do organismo doador, a biblioteca de cDNA contém apenas os genes expressos pelas células empregadas na extração de mRNA, e ainda assim apenas aqueles expressos imediatamente antes do processamento das células no laboratório. Isto implica dizer que uma biblioteca feita com células da mucosa gástrica terá muitos genes diferentes de uma outra biblioteca feita a partir da mucosa oral. Mas também terá muitos outros iguais, pois há genes que são expressos em diferentes tecidos e mesmo outros expressos em qualquer tecido.
O cDNA é uma cópia da mensagem, não possuindo assim intrões e apresentando poucas sequências que não codificam proteínas. Esta ausência de intrões permite a direta transcrição e tradução dos cDNA de células eucarióticas superiores, em bactérias e outros micro-organismos, o que permite a produção em massa de polipeptídeos importantes. A inexistência de intrões facilita igualmente a determinação direta da sequência da mensagem codificada e dedução subsequente da sequência de aminoácidos da proteína por ela codificada, o que se tem demonstrado extremamente útil na identificação de inúmeras proteínas que ainda não o tinham sido genética ou bioquimicamente.
Esquema mostrando bem simplificadamente como se processa a obtenção de uma biblioteca de cDNA |
Método de identificação de moléculas de cDNA de interesse |
Observe agora um esquema que mostra as diferenças principais entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA:
Esse esquema mostra as diferenças entre os processos e os resultados em bibliotecas genômicas e de cDNA |
MOMENTO BÔNUS
Uma das principais funções na construção de bibliotecas genômicas e de cDNA é a possibilidade de se identificar o "perfil genético" de um indivíduo, o que facilita na busca de suspeitos e no julgamento em casos de crimes. Faz-se comparações do material obtido com os materiais dos possíveis suspeitos e, dar-se posteriormente, o veredicto final.
Esse modelo de manipulação do material genético é acompanhado de várias outras formas, como o caso de uma "impressão digital de DNA" (tema da postagem anterior). Uma impressão digital de DNA ocorre através de vários processos, que envolvem a fragmentação de DNA por endonucleases de restrição, uso de gel de agarose, eletroforese e chapa de Raio X.
Para verificar como ocorrem esses processos, entre no endereço abaixo e descubra quem foi o suspeito identificado do crime fictício em questão!
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
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Aqui termina mais um ciclo de postagens. Espero que os leitores tenham aprendido bastante com o tema e que saibam usar as informações obtidas aqui para os devidos fins. Esse foi o principal objetivo desse trabalho. Esse foi o "Bioquímica na luta contra o crime"! Até mais!
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Fontes:
http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliocdna.htm
http://slideplayer.com.br/slide/370893/
http://bmg.fc.ul.pt/Disciplinas/Eng%20Genetica/aulas/Clonagem%20molecular.pdf
https://www.ufpe.br/biolmol/aula5_clonagem1.htm
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
https://www.ufpe.br/biolmol/aula6_clonagem2.htm
http://www.biologia.ufrj.br/~coelho/cursos/genbasmol/genonze.htm
http://www.pbs.org/wgbh/nova/education/body/create-dna-fingerprint.html
https://www.ufpe.br/biolmol/aula6_clonagem2.htm
http://www.biologia.ufrj.br/~coelho/cursos/genbasmol/genonze.htm